海馬神經元原代培養細胞實驗

一、背(bei)景

神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)原代(dai)培養(yang)是將胚胎哺乳(ru)動物中樞神(shen)經(jing)系(xi)統的(de)部(bu)分組織(zhi)，如大腦(nao)皮層、海馬、脊髓等腦(nao)組織(zhi)直接取(qu)出，再接種(zhong)培養(yang)的(de)方(fang)法。目前(qian)國內、外有(you)關神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)培養(yang)的(de)方(fang)法較多，但在(zai)原代(dai)培養(yang)中神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)的(de)純度和產量方(fang)面還存在(zai)一(yi)些急待解決的(de)問(wen)題。由(you)于(yu)神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)是一(yi)種(zhong)高度分化(hua)的(de)細(xi)胞，相(xiang)對(dui)于(yu)其(qi)它(ta)細(xi)胞而(er)言，神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)在(zai)體外更難以(yi)存活和生長。因(yin)此，體外培養(yang)神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)要求(qiu)的(de)培養(yang)方(fang)法和營養(yang)條件均較為(wei)特殊。

神(shen)(shen)經(jing)細胞的體外培養技(ji)術是(shi)研究(jiu)神(shen)(shen)經(jing)源性疾(ji)病的發病機制、進(jin)程的一個重要(yao)工具，能很好的、直觀的反映離體神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)的發育狀況和生(sheng)理活(huo)性，如何建立一個穩定成熟的神經細胞培養體系是神經系統疾病體外實驗研究順利進行的基礎。隨著基礎醫學及臨床醫學研究的逐漸深入，神經細胞的體外培養技術在腦損傷、神經障礙性疾病、衰老相關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

二、海馬神經元原代培養細胞實驗步驟

(1)75% (體積分數)酒(jiu)精(jing)消毒孕鼠,在無(wu)菌條件下取出胎鼠,分離(li)并去除(chu)海馬,置于冷(leng)的(de)無(wu)鈣、鎂(mei)的(de)HBSS液的(de)平皿中( 下置冰袋)。

(2)解(jie)剖(pou)顯微鏡無(wu)菌(jun)條件下仔細剝離海馬。

(3)用(yong)彈簧剪將海馬剪成1cm3大小，消(xiao)化(hua)液37℃消(xiao)化(hua)15-20min，每五分(fen)鐘振蕩一次；

(4)去(qu)掉上(shang)清(qing)，加入(ru)終止液終止消化，吹打10-15次(ci)，不(bu)能有氣泡(pao)，收集上(shang)清(qing)，剩余組織再消化一次(ci)。

(5)4℃1000rpm離心10min，棄上清，加(jia)入種(zhong)植液(ye)1重懸(xuan)，培養箱內差速貼壁(bi)30min；

(6)收集上清，臺盼藍染色(se)計數，按6*105cells/孔種入六孔板（種植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養(yang)箱(xiang)中培養(yang)；

(7)培養第二天，全換液更換為種植液2；

(8)培(pei)養第四天，半量換(huan)液加入5uM的阿糖胞苷(gan)，24h全(quan)量換(huan)液；

(9)之后每周換液兩(liang)次。