大腦皮層神經元原代培養細胞實驗

　　一、背景

　　神經元(yuan)原代培(pei)(pei)養(yang)是將胚胎哺乳動物中(zhong)樞神經系統的(de)(de)部(bu)分組織，如(ru)大腦皮層、海(hai)馬、脊髓等腦組織直接取(qu)出，再接種(zhong)培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)方(fang)法。目前國內、外(wai)有關神經元(yuan)培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)方(fang)法較多，但(dan)在(zai)原代培(pei)(pei)養(yang)中(zhong)神經元(yuan)的(de)(de)純度和(he)產量(liang)方(fang)面還存在(zai)一(yi)些急待解決的(de)(de)問題。由于神經元(yuan)是一(yi)種(zhong)高度分化(hua)的(de)(de)細(xi)胞，相對于其它細(xi)胞而言，神經元(yuan)在(zai)體外(wai)更(geng)難以存活和(he)生長。因此(ci)，體外(wai)培(pei)(pei)養(yang)神經元(yuan)要求的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)方(fang)法和(he)營養(yang)條件均(jun)較為特殊。

　　神(shen)(shen)(shen)經(jing)細胞(bao)的(de)體外(wai)培(pei)養(yang)技(ji)術是研(yan)(yan)究神(shen)(shen)(shen)經(jing)源性(xing)疾(ji)病的(de)發(fa)(fa)病機制、進程的(de)一個重要工具(ju)，能很好的(de)、直(zhi)觀的(de)反映離體神(shen)(shen)(shen)經(jing)元的(de)發(fa)(fa)育狀況和(he)生理(li)活性(xing)，如何建立一個穩定(ding)成熟的(de)神(shen)(shen)(shen)經(jing)細胞(bao)培(pei)養(yang)體系是神(shen)(shen)(shen)經(jing)系統疾(ji)病體外(wai)實驗研(yan)(yan)究順利進行的(de)基(ji)礎。隨(sui)著基(ji)礎醫學及臨床醫學研(yan)(yan)究的(de)逐漸深入，神(shen)(shen)(shen)經(jing)細胞(bao)的(de)體外(wai)培(pei)養(yang)技(ji)術在腦(nao)損傷、神(shen)(shen)(shen)經(jing)障礙性(xing)疾(ji)病、衰老相(xiang)關神(shen)(shen)(shen)經(jing)疾(ji)病方面得到廣(guang)泛(fan)重視和(he)普及應用。

　　二、大腦皮層神經元原代培養細胞實驗步驟

　　(1)75%(體積分(fen)數)酒精消毒孕鼠(shu),在無菌條(tiao)件下(xia)取出胎鼠(shu),分(fen)離并切取大腦(nao)皮層,置(zhi)于冷(leng)的(de)(de)無鈣、鎂的(de)(de)HBSS液(ye)的(de)(de)平皿中(下(xia)置(zhi)冰袋)。

　　(2)解(jie)剖顯微鏡無(wu)菌(jun)條(tiao)件下仔細剝離大腦(nao)皮層。

　　(3)用彈(dan)簧(huang)剪(jian)將(jiang)大(da)腦(nao)皮層剪(jian)成1cm3大(da)小，消化液37℃消化15-20min，每五分鐘振(zhen)蕩一次；

　　(4)去掉上清，加入終(zhong)止液終(zhong)止消化，吹(chui)打10-15次(ci)，不能有氣(qi)泡，收集(ji)上清，剩余組織(zhi)再消化一次(ci)。

　　(5)4℃1000rpm離心10min，棄(qi)上清，加入種(zhong)植液(ye)1重懸，培養箱內(nei)差速貼壁30min；

　　(6)收集上清，臺盼藍(lan)染(ran)色計數(shu)，按6*105cells/孔(kong)(kong)種入(ru)六孔(kong)(kong)板（種植(zhi)液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕(shi)度的培養(yang)箱(xiang)中培養(yang)；

　　(7)培養第二天，全換液更換為種植(zhi)液2；

　　(8)培養第四天，半量換液(ye)加入5uM的阿糖(tang)胞苷(gan)，24h全(quan)量換液(ye)；

　　(9)之后(hou)每周(zhou)換液兩次。