脊髓神經元原代培養細胞實驗

　　一、背景

　　神(shen)經元(yuan)(yuan)原(yuan)(yuan)代培養(yang)(yang)是將胚胎哺乳動(dong)物中樞神(shen)經系統的(de)(de)部分組(zu)織(zhi)，如大(da)腦皮層(ceng)、海馬、脊(ji)髓等腦組(zu)織(zhi)直接取出，再接種(zhong)培養(yang)(yang)的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)。目前國內、外(wai)有關神(shen)經元(yuan)(yuan)培養(yang)(yang)的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)較多，但在(zai)(zai)原(yuan)(yuan)代培養(yang)(yang)中神(shen)經元(yuan)(yuan)的(de)(de)純度和(he)產量方(fang)(fang)面還存(cun)(cun)在(zai)(zai)一些(xie)急待解決的(de)(de)問(wen)題。由于(yu)神(shen)經元(yuan)(yuan)是一種(zhong)高度分化(hua)的(de)(de)細胞，相對于(yu)其它細胞而言，神(shen)經元(yuan)(yuan)在(zai)(zai)體外(wai)更難以存(cun)(cun)活和(he)生長。因此(ci)，體外(wai)培養(yang)(yang)神(shen)經元(yuan)(yuan)要求的(de)(de)培養(yang)(yang)方(fang)(fang)法(fa)和(he)營養(yang)(yang)條件(jian)均(jun)較為特(te)殊。

　　神(shen)經(jing)(jing)(jing)細(xi)胞的(de)(de)(de)體外(wai)培(pei)養技(ji)(ji)術是(shi)(shi)研(yan)究神(shen)經(jing)(jing)(jing)源性(xing)疾(ji)(ji)(ji)病的(de)(de)(de)發病機制、進程(cheng)的(de)(de)(de)一個(ge)重(zhong)要工具(ju)，能很好的(de)(de)(de)、直(zhi)觀的(de)(de)(de)反映離體神(shen)經(jing)(jing)(jing)元的(de)(de)(de)發育狀況和生理活性(xing)，如何建立一個(ge)穩定成(cheng)熟的(de)(de)(de)神(shen)經(jing)(jing)(jing)細(xi)胞培(pei)養體系(xi)是(shi)(shi)神(shen)經(jing)(jing)(jing)系(xi)統疾(ji)(ji)(ji)病體外(wai)實驗研(yan)究順利進行的(de)(de)(de)基(ji)礎。隨著基(ji)礎醫學(xue)及臨(lin)床醫學(xue)研(yan)究的(de)(de)(de)逐漸深入，神(shen)經(jing)(jing)(jing)細(xi)胞的(de)(de)(de)體外(wai)培(pei)養技(ji)(ji)術在腦損傷、神(shen)經(jing)(jing)(jing)障礙性(xing)疾(ji)(ji)(ji)病、衰老相(xiang)關神(shen)經(jing)(jing)(jing)疾(ji)(ji)(ji)病方面得(de)到廣泛(fan)重(zhong)視和普及應(ying)用。

　　二、脊髓神經元原代培養細胞實驗實驗步驟

　　(1)75%(體積(ji)分數)酒精(jing)消毒(du)孕鼠,在無(wu)菌條件下取出胎(tai)鼠,分離并切取脊(ji)髓,置于冷的無(wu)鈣、鎂的HBSS液(ye)的平(ping)皿中(下置冰袋)。

　　(2)解剖顯(xian)微(wei)鏡無菌條件(jian)下仔(zi)細(xi)剝離(li)脊膜及(ji)血管(guan)。

　　(3)用(yong)彈簧(huang)剪(jian)將脊髓剪(jian)成1cm3大小，消化(hua)(hua)液37℃消化(hua)(hua)15-20min，每五(wu)分鐘振蕩一次；

　　(4)去掉上清(qing)(qing)，加入終止(zhi)液終止(zhi)消化(hua)(hua)，吹(chui)打10-15次，不能有氣泡，收集上清(qing)(qing)，剩余組(zu)織(zhi)再消化(hua)(hua)一次。

　　(5)4℃1000rpm離(li)心10min，棄(qi)上清(qing)，加入(ru)種(zhong)植液1重(zhong)懸，培(pei)養箱內差速貼(tie)壁30min；

　　(6)收集上清，臺盼藍染色計數，按(an)6*105cells/孔種(zhong)入六(liu)孔板（種(zhong)植(zhi)液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養箱中培養；

　　(7)培養第二(er)天，全換液更換為種植液2；

　　(8)培養第四天，半(ban)量換(huan)液(ye)加入(ru)5uM的阿糖(tang)胞苷，24h全量換(huan)液(ye)；

　　(9)之后每周換液兩次。