一、服務介紹

　　免疫熒光實驗服務：細(xi)(xi)胞(bao)化學是根據(ju)抗原(yuan)(yuan)抗體(ti)反應(ying)的(de)原(yuan)(yuan)理(li)，先將已知的(de)抗原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)抗體(ti)標記(ji)上熒(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)制成熒(ying)光(guang)(guang)標記(ji)物(wu)，再用這(zhe)種熒(ying)光(guang)(guang)抗體(ti)（或(huo)(huo)抗原(yuan)(yuan)）作(zuo)為分子探(tan)針(zhen)檢查(cha)細(xi)(xi)胞(bao)或(huo)(huo)組(zu)織(zhi)內(nei)的(de)相應(ying)抗原(yuan)(yuan)（或(huo)(huo)抗體(ti)）。在細(xi)(xi)胞(bao)或(huo)(huo)組(zu)織(zhi)中形成的(de)抗原(yuan)(yuan)抗體(ti)復合物(wu)上含有(you)熒(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)，利用熒(ying)光(guang)(guang)顯微鏡觀察標本，熒(ying)光(guang)(guang)素(su)(su)受激發光(guang)(guang)的(de)照射而發出明亮的(de)熒(ying)光(guang)(guang)（黃綠(lv)色或(huo)(huo)桔紅色），可以看見(jian)熒(ying)光(guang)(guang)所(suo)在的(de)細(xi)(xi)胞(bao)或(huo)(huo)組(zu)織(zhi)，從而確定(ding)抗原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)抗體(ti)的(de)性質、定(ding)位，以及利用定(ding)量(liang)技術(shu)測定(ding)含量(liang)。

　　二、實驗原理

　　將不影(ying)響抗(kang)原(yuan)抗(kang)體活性(xing)的(de)熒光色(se)素標記(ji)在(zai)抗(kang)體（或抗(kang)原(yuan)）上(shang)，與(yu)其相應(ying)(ying)的(de)抗(kang)原(yuan)（或抗(kang)體）結合(he)后(hou)，在(zai)熒光顯微鏡下呈現(xian)一種特異性(xing)熒光反應(ying)(ying)。

　　三、實驗流程

　　免疫熒光實驗服務單標記方法

　　單標記(ji)是指只(zhi)標記(ji)一種蛋(dan)白質分子，方法比較(jiao)簡單，只(zhi)要按照(zhao)染色(se)步驟去做，通常不存在(zai)太多的問題。但(dan)要注意(yi)固定(ding)液的選擇，固定(ding)液選擇的合適與否，可能會直接影響(xiang)染色(se)結(jie)果。具體染色(se)方法如下。

　　1、所需材料(liao)與試劑

　　a,培養(yang)在(zai)蓋玻片或玻璃(li)培養(yang)皿中融合程度達到60%-70%的細胞。

　　b,一抗、FITC或TRITC標(biao)記的二抗。

　　c,4%多聚甲醛固定(ding)液或冷丙酮固定(ding)液(-20℃預冷20min)。

　　d,封閉液。

　　e,0.01mol／LPBS緩沖(chong)液(ye)。

　　2、染色方法

　　a,取出培養(yang)有細(xi)胞(bao)的蓋玻片(pian)或(huo)glass-bottom培養(yang)皿，用0.01MPBS洗(xi)2-3遍(bian)。

　　b,加(jia)入0.3%的Tritonx-100,37℃,30rain

　　c,加入4%多聚甲醛試問(wen)固定(ding)30min或(huo)冷丙酮4℃固定(ding)10min。

　　d，正(zheng)常阻斷血(xue)清(qing)1:20封閉試問20-30min，抑制IgG的(de)非特異性結合。阻斷血(xue)清(qing)選擇與(yu)二抗同一種屬的(de)正(zheng)常血(xue)清(qing)。

　　e,去掉正常血清(qing)，直接加入一抗，37℃孵育(yu)1h或4℃過夜。抗體以0.01mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃(nong)度需(xu)經試驗而定)。

　　f,0.3%TritonX-100洗5min，0.01mol/IPBS洗5min，0.3%TritonX5min，0.01MPBS洗5rain。

　　g,加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

　　h,0.3%TritonX-100洗(xi)5rain，0.01mol/LPBS洗(xi)5min，0.3%TritonX5min，0.01mol/LPBS洗(xi)5min，用濾紙吸干。

　　i,90%甘(gan)油(PBS配制(zhi))封片。

　　j,激(ji)光掃(sao)描共焦顯微鏡下觀察(cha)，或(huo)于4℃避光保存。

　　雙標(biao)記(ji)方(fang)(fang)法(fa)(fa)：是指同時(shi)(shi)標(biao)記(ji)細胞內兩種(zhong)(zhong)蛋白質分子(zi)，當(dang)懷疑某種(zhong)(zhong)配體(ti)(ti)與已(yi)知(zhi)受體(ti)(ti)結合后(hou)可(ke)(ke)用此方(fang)(fang)法(fa)(fa)加以(yi)證明。此方(fang)(fang)法(fa)(fa)稍微復(fu)雜一(yi)些(xie)，應注意(yi)所(suo)(suo)用的一(yi)抗(kang)(kang)是來自(zi)(zi)不(bu)同種(zhong)(zhong)屬(shu)動物的兩種(zhong)(zhong)特異(yi)性抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(例如：A抗(kang)(kang)體(ti)(ti)為多克隆(long)(long)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)，來自(zi)(zi)家(jia)兔(tu)；B抗(kang)(kang)體(ti)(ti)為單克隆(long)(long)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)，來自(zi)(zi)小鼠)。其次，兩種(zhong)(zhong)二抗(kang)(kang)所(suo)(suo)帶熒光(guang)素的發射(she)光(guang)不(bu)應重疊(die)，且盡量遠離，通常可(ke)(ke)以(yi)選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色(se)(se)時(shi)(shi)兩種(zhong)(zhong)一(yi)抗(kang)(kang)可(ke)(ke)以(yi)同時(shi)(shi)孵育，然后(hou)可(ke)(ke)以(yi)同時(shi)(shi)孵育兩種(zhong)(zhong)二抗(kang)(kang)。但當(dang)染色(se)(se)結果一(yi)種(zhong)(zhong)顏(yan)色(se)(se)非常弱，而(er)另一(yi)種(zhong)(zhong)顏(yan)色(se)(se)比(bi)較強時(shi)(shi)，應考慮先孵育顏(yan)色(se)(se)較弱的二抗(kang)(kang)。其他步驟同免疫熒光(guang)單標(biao)記(ji)。

　　四、客戶提供

　　細(xi)胞(bao)株(zhu)或細(xi)胞(bao)爬片。注：細(xi)胞(bao)爬片不宜太密；細(xi)胞(bao)固定。組(zu)織切(qie)片，一抗

　　五、公司提供

　　基本實驗步(bu)驟(zou)、藥(yao)品、樣品處理、圖片及圖片分析，熒光(guang)顯(xian)微鏡(jing)或(huo)共(gong)聚焦顯(xian)微鏡(jing)拍攝(she)

　　實驗(yan)周(zhou)期：1-3周(zhou)