原代細胞分離

　　一、細胞培養

　　1.取(qu)(qu)材在無菌(jun)環境下從機體(ti)取(qu)(qu)出(chu)某種組織(zhi)細胞（視實驗目的(de)而(er)定），經(jing)過的(de)處理（如(ru)消(xiao)化分(fen)散細胞、分(fen)離等）后接入培養(yang)器血中(zhong)，這一過程(cheng)稱為(wei)取(qu)(qu)材。如(ru)是(shi)細胞株的(de)擴大培養(yang)則無取(qu)(qu)材這一過程(cheng)。機體(ti)取(qu)(qu)出(chu)的(de)組織(zhi)細胞的(de)初次(ci)培養(yang)稱為(wei)原(yuan)代培養(yang)。

　　2.培(pei)養(yang)將(jiang)(jiang)取(qu)(qu)得(de)的(de)(de)組織細胞接入(ru)培(pei)養(yang)瓶(ping)或培(pei)養(yang)板中的(de)(de)過程(cheng)稱(cheng)為培(pei)養(yang)。3凍(dong)(dong)存(cun)及復蘇（可參閱后面(mian)有關章節）為了保(bao)存(cun)細胞，特別是(shi)不(bu)易獲得(de)的(de)(de)突變型細胞或細胞株(zhu)，要將(jiang)(jiang)細胞凍(dong)(dong)存(cun)。凍(dong)(dong)存(cun)的(de)(de)溫度一般用液氮的(de)(de)溫度－196℃，將(jiang)(jiang)細胞收集至凍(dong)(dong)存(cun)管中加入(ru)含保(bao)護(hu)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的(de)(de)培(pei)養(yang)基，以(yi)的(de)(de)冷(leng)卻速度凍(dong)(dong)存(cun)，終保(bao)存(cun)于液氮中。在(zai)極低的(de)(de)溫度下(xia)，細胞保(bao)存(cun)的(de)(de)時間是(shi)無限的(de)(de)。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取(qu)(qu)出凍(dong)(dong)存(cun)管后，立即放(fang)入(ru)37℃水中，使(shi)之在(zai)一分鐘(zhong)內迅(xun)速融解(jie)。然(ran)后將(jiang)(jiang)細胞轉入(ru)培(pei)養(yang)器皿中進行培(pei)養(yang)。

　　二、原代細胞分離

　　凡是來源于胚胎、組(zu)織器(qi)官及外周血，經(jing)特殊分(fen)離(li)方法制備而(er)來的(de)(de)(de)原初培養的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)稱之為原代細胞(bao)(bao)。1懸浮(fu)細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)分(fen)離(li)方法組(zu)織材(cai)料(liao)若來自血液、羊水(shui)、胸水(shui)或腹水(shui)的(de)(de)(de)懸液材(cai)料(liao)，簡單的(de)(de)(de)方法是采用1000r/min的(de)(de)(de)低速離(li)心10分(fen)鐘。經(jing)離(li)心后由(you)于各種細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)比重(zhong)不同可在分(fen)層液中(zhong)形(xing)成不同層，這樣可根據需要收(shou)獲(huo)目的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)。2實體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)的(de)(de)(de)分(fen)離(li)方法對于實體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)，由(you)于細胞(bao)(bao)間結合緊密，為了使組(zu)織中(zhong)的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)充分(fen)分(fen)散(san)，形(xing)成細胞(bao)(bao)懸液，可采用機(ji)械分(fen)散(san)法（物理裂解）和消(xiao)化分(fen)離(li)法。

　　三、細胞增殖檢測技(ji)術(shu)

　　目前主要有兩(liang)種用(yong)于檢測(ce)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)增殖(zhi)能(neng)力(li)的(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)。一(yi)(yi)種是(shi)直接的(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)，通過(guo)直接測(ce)定(ding)進行分裂的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數(shu)(shu)來評價細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)增殖(zhi)能(neng)力(li)。另一(yi)(yi)種是(shi)間(jian)接的(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)，即細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)活力(li)（cellviability）檢測(ce)方(fang)法(fa)，通過(guo)檢測(ce)樣品中健康細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)目來評價細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)增殖(zhi)能(neng)力(li)。顯(xian)然，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)活力(li)檢測(ce)法(fa)并不能(neng)證(zheng)明檢測(ce)樣品中的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)是(shi)否在(zai)增殖(zhi)。如(ru)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)某一(yi)(yi)培(pei)養條件下會自發啟動凋亡程序，但藥物的(de)(de)(de)(de)干擾(rao)可(ke)抑制凋亡的(de)(de)(de)(de)發生(sheng)；這時若(ruo)采(cai)用(yong)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)活力(li)檢測(ce)法(fa)，顯(xian)然可(ke)以區分兩(liang)種條件下的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數(shu)(shu)量(liang)，但我們并不能(neng)從藥物干擾(rao)組細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數(shu)(shu)大(da)于對照組的(de)(de)(de)(de)事實說明藥物可(ke)促進細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)增殖(zhi)的(de)(de)(de)(de)結論。所以直接的(de)(de)(de)(de)證(zheng)據應該采(cai)用(yong)方(fang)法(fa)一(yi)(yi)。

　　其(qi)中常見檢測(ce)：CCK8檢測(ce)法，MTT檢測(ce)法，Brdu檢測(ce)法，Edu檢測(ce)法，平板(ban)克隆形成。

　　四、細(xi)胞周期(qi)檢測技術

　　細(xi)胞周(zhou)期指由細(xi)胞分(fen)裂(lie)結束(shu)到下一(yi)次細(xi)胞分(fen)裂(lie)結束(shu)所經(jing)歷的過程，所需的時(shi)(shi)間叫細(xi)胞周(zhou)期時(shi)(shi)間。

　　常用的方法：流式檢測細胞周期(qi)，標記有絲分(fen)裂(lie)百分(fen)率(lv)法。

　　五(wu)、細胞凋(diao)亡檢測(ce)

　　常(chang)見檢測方法：流式檢測細胞凋亡，線(xian)粒體膜電位(wei)，活性(xing)氧(yang)檢測，Hoechst染色(se)，電鏡，TUNEL。

　　六(liu)、細胞轉(zhuan)移能(neng)力(li)檢測

　　常見檢(jian)測方法：細胞劃痕實驗，Transwell實驗，Invasion實驗

　　七、其他實驗

　　細胞惡性程度：軟瓊脂實驗

　　細(xi)胞屏(ping)障：跨膜電(dian)阻、熒光黃(huang)透(tou)過率(lv)、細(xi)胞粘附實(shi)驗、共(gong)培(pei)養實(shi)驗、裸鼠成瘤實(shi)驗。