骨組織切片及trap染色(se)實驗步驟(zou)

1、 骨(gu)組織(zhi)脫(tuo)鈣(gai)(gai)(gai)(gai):新鮮骨(gu)組織(zhi)固定(ding)(ding)于(yu)4%多聚(ju)jia醛24h以上，將組織(zhi)從固定(ding)(ding)液(ye)(ye)取出(chu)置于(yu)EDTA脫(tuo)鈣(gai)(gai)(gai)(gai)液(ye)(ye)內(nei)脫(tuo)鈣(gai)(gai)(gai)(gai)(不(bu)能用含酸的(de)脫(tuo)鈣(gai)(gai)(gai)(gai)液(ye)(ye)脫(tuo)鈣(gai)(gai)(gai)(gai))，每3天(tian)換一次脫(tuo)鈣(gai)(gai)(gai)(gai)液(ye)(ye)，至(zhi)骨(gu)組織(zhi)針扎(zha)可以順利通過為(wei)止。

2、 取材:在通風櫥內用**刀將(jiang)目的(de)部位組織(zhi)修平整，將(jiang)修切好的(de)組織(zhi)和對應的(de)標簽放于脫(tuo)水盒內。

3、 脫水(shui):將(jiang)脫水(shui)盒放進吊籃里于脫水(shui)機(ji)內依(yi)次梯(ti)度(du)酒(jiu)精(jing)(jing)進行(xing)脫水(shui)。75%酒(jiu)精(jing)(jing)4h-85%酒(jiu)精(jing)(jing)2h-90%酒(jiu)精(jing)(jing)2h-95%酒(jiu)精(jing)(jing)1h-無水(shui)醇 30min-無水(shui)/醇ll30min-醇苯(ben)(ben)5-10min-二甲苯(ben)(ben)|5-10min-二甲苯(ben)(ben)ll5-10min-蠟(la)| 1h-蠟(la)|| 1h-蠟(la)Il1h.

4、 包(bao)(bao)(bao)埋(mai)(mai)(mai):將(jiang)浸好蠟的(de)組(zu)(zu)織于(yu)包(bao)(bao)(bao)埋(mai)(mai)(mai)*內(nei)進行包(bao)(bao)(bao)埋(mai)(mai)(mai)。先將(jiang)融化的(de)蠟放(fang)入包(bao)(bao)(bao)埋(mai)(mai)(mai)框(kuang)，待蠟凝固(gu)之前將(jiang)組(zu)(zu)織從(cong)脫水(shui)盒內(nei)取(qu)出按照包(bao)(bao)(bao)埋(mai)(mai)(mai)面的(de)要(yao)求放(fang)入包(bao)(bao)(bao)埋(mai)(mai)(mai)框(kuang)并(bing)貼上對應的(de)標簽。于(yu)-20°凍(dong)臺冷(leng)卻，蠟凝固(gu)后將(jiang)蠟塊(kuai)從(cong)包(bao)(bao)(bao)埋(mai)(mai)(mai)框(kuang)中取(qu)出并(bing)修整蠟塊(kuai)。

5、 切片(pian):將修整好的蠟(la)(la)塊(kuai)置于石蠟(la)(la)切片(pian)機上切片(pian)，片(pian)厚(hou)4um。 切片(pian)漂浮于攤片(pian)機40℃ 溫水(shui)上將組織展(zhan)平，用載玻片(pian)將組只(zhi)撈(lao)起，并放進60°℃烘箱內烤(kao)片(pian)，待水(shui)烤(kao)干蠟(la)(la)烤(kao)化后取出常溫保存備(bei)用。

6、石蠟(la)切(qie)片(pian)脫蠟(la)至水:依次將切(qie)片(pian)放(fang)入(ru)二(er)甲苯I20min二(er)甲苯Ⅱ20min-無水乙(yi)醇I10min-無水乙(yi)醇Ⅱ10min-95%酒精

5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

7、染液(ye)(ye)(ye)(ye)配制(zhi):A液(ye)(ye)(ye)(ye):0.1mol/L醋酸(suan)(suan)(suan)(suan)緩(huan)沖液(ye)(ye)(ye)(ye)PH5.0:醋酸(suan)(suan)(suan)(suan)Na1.3608q+蒸餾水100ml溶(rong)(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)，用(yong)Bing醋酸(suan)(suan)(suan)(suan)調PH值到5.0。B液(ye)(ye)(ye)(ye):六偶氨副品(pin)紅 4%業肖酸(suan)(suan)(suan)(suan)Na:2g亞(ya)當酸(suan)(suan)(suan)(suan)Na+去(qu)離子水50ml副品(pin)紅溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)(ye):副品(pin)紅2.5q+去(qu)離子水50ml+濃鹽酸(suan)(suan)(suan)(suan)7.5ml，加熱至(zhi)(zhi)90°溶(rong)(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)后過濾，4°棕(zong)色瓶保存。臨用(yong)前4%亞(ya)肖酸(suan)(suan)(suan)(suan)Na與副品(pin)紅溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)(ye)等比(bi)例混合。C液(ye)(ye)(ye)(ye):萘酚AS-Bl磷酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯20mg+N.N-2甲基甲酰胺1ml溶(rong)(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)。孵(fu)(fu)育液(ye)(ye)(ye)(ye)配制(zhi):A液(ye)(ye)(ye)(ye)18ml+B液(ye)(ye)(ye)(ye)1ml+C液(ye)(ye)(ye)(ye)1ml混勻(yun)，用(yong)1MNaOH或1M鹽酸(suan)(suan)(suan)(suan)調pH至(zhi)(zhi)5.0，再(zai)加酒石酸(suan)(suan)(suan)(suan)鉀Na0.282q，充(chong)分溶(rong)(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)過濾后備用(yong)即為(wei)TRAP孵(fu)(fu)育液(ye)(ye)(ye)(ye)。

8、 染色;切片詈干(gan)TRAP孵育液(ye)內37°孵育50min，鏡下觀察破骨(gu)細胞呈灑紅色為止，蒸(zheng)餾水酒(jiu)洗。

9、蘇木素染細胞核(he):切片(pian)入Harris蘇木素染3-8min，自來(lai)水洗(xi)(xi)，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來(lai)水沖洗(xi)(xi)，0.6%氨,水返(fan)藍(lan)，流(liu)水沖洗(xi)(xi)。

10、脫水封(feng)片:將切片依次放(fang)入95%酒(jiu)(jiu)精(jing)l5min-95%酒(jiu)(jiu)精(jing)l5min-無水/醇I5min-無水/醇T5min-甲苯15min-單

苯(ben)(ben)Ⅱ5min中(zhong)脫水透明，將切片從二甲(jia)苯(ben)(ben)拿出來(lai)稍晾干，中(zhong)性樹膠封片。

11、 顯微鏡(jing)鏡(jing)檢，冬像(xiang)采(cai)集(ji)分(fen)析(xi)。

染(ran)色(se)結果:破骨細胞胞漿呈酒(jiu)紅色(se)，核藍色(se)。