一、分子克隆與質粒載體構建實驗服務介紹(shao)

分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA的(de)片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。

二、分子克隆與質粒載體構建實驗

外源DNA與(yu)載體(ti)(ti)(ti)(ti)分(fen)子(zi)的(de)(de)連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)就(jiu)是(shi)DNA重(zhong)(zhong)組(zu)，這樣重(zhong)(zhong)新組(zu)合的(de)(de)DNA叫做重(zhong)(zhong)組(zu)體(ti)(ti)(ti)(ti)或重(zhong)(zhong)組(zu)子(zi)。重(zhong)(zhong)組(zu)的(de)(de)DNA分(fen)子(zi)是(shi)在DNA連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)酶(mei)(mei)的(de)(de)作(zuo)用下,有Mg2+、ATP存在的(de)(de)連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)緩沖系(xi)統中，將分(fen)別經酶(mei)(mei)切(qie)的(de)(de)載體(ti)(ti)(ti)(ti)分(fen)子(zi)與(yu)外源DNA分(fen)子(zi)進行(xing)連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)。DNA連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)酶(mei)(mei)有兩(liang)(liang)種：T4噬菌(jun)體(ti)(ti)(ti)(ti)DNA連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)酶(mei)(mei)和大腸(chang)桿菌(jun)DNA連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)酶(mei)(mei)。兩(liang)(liang)種DNA連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)酶(mei)(mei)都有將兩(liang)(liang)個帶有相同粘性末(mo)端(duan)的(de)(de)DNA分(fen)子(zi)連(lian)在一起的(de)(de)功能，而且T4噬菌(jun)體(ti)(ti)(ti)(ti)DNA連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)酶(mei)(mei)還有—種大腸(chang)桿菌(jun)連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)酶(mei)(mei)沒有的(de)(de)特性，即能使兩(liang)(liang)個平末(mo)端(duan)的(de)(de)雙(shuang)鏈DNA分(fen)子(zi)連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)起來。但這種連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)的(de)(de)效(xiao)(xiao)率(lv)比粘性末(mo)端(duan)的(de)(de)連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)效(xiao)(xiao)率(lv)低(di)，一般可通過提(ti)高T4噬菌(jun)體(ti)(ti)(ti)(ti)DNA連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)酶(mei)(mei)濃度或增(zeng)加(jia)DNA濃度來提(ti)高平末(mo)端(duan)的(de)(de)連(lian)接(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)效(xiao)(xiao)率(lv)。

    T4噬菌(jun)體DNA連(lian)接酶(mei)(mei)(mei)催化DNA連(lian)接反應分(fen)為(wei)3步：，T4DNA連(lian)接酶(mei)(mei)(mei)與輔助(zhu)因子ATP形(xing)成酶(mei)(mei)(mei)—AMP復(fu)合(he)物(wu)；然后，酶(mei)(mei)(mei)—AMP復(fu)合(he)物(wu)再結合(he)到具有(you)5’磷(lin)酸(suan)基(ji)和3’羥基(ji)切(qie)口的(de)DNA上，使(shi)DNA腺苷化；后產(chan)生一個新的(de)磷(lin)酸(suan)二酯鍵(jian)，把(ba)切(qie)口封起來。

    DNA重組的(de)方法主要有(you)粘(zhan)端連(lian)接(jie)(jie)法和(he)平端連(lian)接(jie)(jie)法，為了防止載體本身的(de)自連(lian)，可以通過(guo)(牛(niu)小(xiao)腸堿性(xing)磷(lin)酸酶)CIP處理克服。

    連接反應的(de)(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)在37℃時有(you)利于(yu)連接酶(mei)的(de)(de)活(huo)性.但是在這個(ge)溫(wen)(wen)度(du)(du)下，粘性末端的(de)(de)氫(qing)鍵結合(he)是不穩定的(de)(de)。因此人(ren)們找到了一個(ge)折中(zhong)溫(wen)(wen)度(du)(du)，即12-16℃，連接12-16h(過夜(ye))，這樣既可(ke)大限度(du)(du)地(di)發揮(hui)連接酶(mei)的(de)(de)活(huo)性，又兼顧到短暫配(pei)對結構的(de)(de)穩定。

三、實驗流程

目的(de)DNA的(de)擴增(zeng)和純化；

連(lian)接(jie)反應(ying)；

電泳檢(jian)測連接(jie)產(chan)物。

四、客戶提供

樣(yang)本(ben)DNA，基因序列，試劑盒。

五、公司提供

構(gou)建好的載體，電泳膠圖，測序(xu)結果。

實驗周期：大約(yue)1-2月。