文獻內容講解

巨(ju)自(zi)噬(shi)（以(yi)下簡稱(cheng)自(zi)噬(shi)）涉及膜的初始形成，將細胞(bao)質(zhi)中需(xu)要分(fen)解的物質(zhi)隔離形成雙膜自(zi)噬(shi)體(ti)，自(zi)噬(shi)體(ti)隨(sui)后與溶酶體(ti)接觸(chu)，進而融(rong)合，從而使物質(zhi)分(fen)解和(he)由(you)此產生(sheng)的大分(fen)子循環，以(yi)在饑餓和(he)細胞(bao)應激期(qi)間(jian)獲得穩態。

自(zi)噬(shi)(shi)(shi)體(ti)(ti)的(de)生物(wu)(wu)發生通過ULK1激酶復(fu)合(he)物(wu)(wu)和III類磷脂酰肌醇3激酶復(fu)合(he)物(wu)(wu)1(PIK3C3-C1)聚集到(dao)內(nei)質網(ER)相(xiang)關位(wei)點(dian)啟動，新形成的(de)自(zi)噬(shi)(shi)(shi)體(ti)(ti)即(ji)從這些(xie)位(wei)點(dian)發出。自(zi)噬(shi)(shi)(shi)體(ti)(ti)膜(mo)很(hen)大程(cheng)度上缺乏跨膜(mo)蛋白(bai)，因此認(ren)為其形成受膜(mo)相(xiang)關蛋白(bai)及其脂質組成和分布的(de)調節(jie)。

前人(ren)研究表明，自(zi)(zi)噬(shi)體(ti)(ti)富含不飽和(he)脂肪酸，而這些脂肪酸是自(zi)(zi)噬(shi)體(ti)(ti)形成所必(bi)需的(de)。這些研究表明，降低膜序有利(li)于(yu)自(zi)(zi)噬(shi)的(de)啟動(dong)，可(ke)能(neng)是通過產生已知的(de)自(zi)(zi)噬(shi)體(ti)(ti)形成所需的(de)柔性高(gao)度(du)彎曲(qu)的(de)膜。除了磷脂、膽固醇(chun)是哺乳動(dong)物膜的(de)一個重要組(zu)成部分，它的(de)豐度(du)也是膜秩(zhi)序和(he)流動(dong)性的(de)決定因素。

細胞內膽固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)水平通過生物(wu)發生和細胞外膽固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)攝取進(jin)行(xing)雙重調節。除(chu)了低密度脂蛋(dan)(dan)白(bai)受體(LDLR)途(tu)徑外，一(yi)些膽固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)轉(zhuan)(zhuan)運蛋(dan)(dan)白(bai)也被證明直接(jie)從質(zhi)膜(PM)介導膽固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)的輸入(ru)和胞內轉(zhuan)(zhuan)運。這(zhe)(zhe)種膽固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)轉(zhuan)(zhuan)運蛋(dan)(dan)白(bai)例如 GramD 家(jia)族蛋(dan)(dan)白(bai)（由(you)GramD1A、GramD1B、GramD1C（也稱為ASTER蛋(dan)(dan)白(bai)）、GramD2和GramD3)，以其N-末端區域(yu)的脂質(zhi)結(jie)(jie)合(he)PH相似結(jie)(jie)構域(yu)命名。在這(zhe)(zhe)5個(ge)成員中，只(zhi)有GramD1A、GramD1B和GramD1C（這(zhe)(zhe)里統稱為GramD1S)含有一(yi)個(ge)與甾醇(chun)(chun)(chun)結(jie)(jie)合(he)的巨大結(jie)(jie)構域(yu)，允許它們促(cu)進(jin)PM到ER膽固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)的輸入(ru)。

GramD1S的缺失(shi)導致細胞(bao)膜中可(ke)及膽(dan)固醇的積累,而GramD1A和(he)GramD1B缺失(shi)的小鼠巨噬(shi)細胞(bao)也表現出甾醇調節元件結(jie)合蛋白2(SREBP2)靶(ba)基因的上調表達，表明ER膽(dan)固醇降低。由于對GramD家族蛋白質的研究數量有限(xian)，它(ta)們的生物(wu)學重要性仍未(wei)深(shen)入了解。

膽(dan)固醇耗竭促進自噬啟動

此項研究用快速清除細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)中膽(dan)固醇(chun)(chun)(chun)的(de)MBCD分(fen)析了(le)(le)(le)膽(dan)固醇(chun)(chun)(chun)耗(hao)盡(jin)后饑(ji)餓(e)(e)(e)誘(you)(you)導(dao)的(de)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)的(de)短期影響。對(dui)照細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)相比，在(zai)基礎條件下，膽(dan)固醇(chun)(chun)(chun)耗(hao)竭(jie)導(dao)致LC3B(LC3B-II)的(de)膜(mo)結(jie)合形式(shi)增加了(le)(le)(le)三倍，這(zhe)(zhe)在(zai)缺(que)乏膽(dan)固醇(chun)(chun)(chun)的(de)饑(ji)餓(e)(e)(e)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中進一步增強(qiang)(qiang)；據內源性LC3B點狀(zhuang)體的(de)免疫熒(ying)光顯微鏡觀(guan)察，膽(dan)固醇(chun)(chun)(chun)耗(hao)竭(jie)增加了(le)(le)(le)Fed和Starved細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中自(zi)(zi)噬(shi)(shi)體的(de)形成(cheng)。這(zhe)(zhe)些結(jie)果表明，膽(dan)固醇(chun)(chun)(chun)耗(hao)竭(jie)促進自(zi)(zi)噬(shi)(shi)誘(you)(you)導(dao)，并增強(qiang)(qiang)饑(ji)餓(e)(e)(e)誘(you)(you)導(dao)的(de)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)。

為(wei)了闡(chan)明(ming)細(xi)胞膽(dan)固(gu)醇(chun)調節劑(ji)是否(fou)也影響自(zi)(zi)噬(shi)(shi)，設(she)計實驗耗竭(jie)在膜接(jie)觸點作為(wei)非泡(pao)狀細(xi)胞器間膽(dan)固(gu)醇(chun)運動(dong)中(zhong)介的(de)膽(dan)固(gu)醇(chun)轉運蛋白(bai)。鑒于復合物通過其C端區域22和GramD1A參與自(zi)(zi)噬(shi)(shi)，為(wei)明(ming)確GramD1A家族的(de)其他成(cheng)員是否(fou)也參與自(zi)(zi)噬(shi)(shi)，用siRNA轉染穩定(ding)誘(you)導(dao)表達自(zi)(zi)噬(shi)(shi)報告基因Mcherry-EGFP-LC3B（黃(huang)色自(zi)(zi)噬(shi)(shi)體，由于酸性溶(rong)酶體中(zhong)EGFP猝(cu)滅而產(chan)生(sheng)的(de)紅自(zi)(zi)溶(rong)酶體）的(de)U2OS細(xi)胞，分別耗盡每個Gram家族成(cheng)員。這些實驗數據表明(ming)，GramD1C介導(dao)的(de)膽(dan)固(gu)醇(chun)轉運調節饑餓誘(you)導(dao)的(de)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)。

U2OS細胞中(zhong)GramD1C耗(hao)竭導致(zhi)了幾種早期自噬機制成分(fen)的(de)增加，如ATG13、ATG16L1和PTDINs(3)P效應蛋白WIPI2B40；而且與膽固(gu)醇(chun)耗(hao)竭細胞中(zhong)的(de)結果一致(zhi)，研究發現GramD1C耗(hao)竭促進(jin)饑餓細胞中(zhong)EGFP-BAT的(de)募(mu)集，這些結果提示GramD1C通過降低膜曲率抑(yi)制自噬體的(de)啟(qi)動(dong)。

為了(le)(le)研究GramD1C是否(fou)可能調(diao)(diao)節(jie)內(nei)質(zhi)網(wang)和線粒(li)(li)體之間的(de)膽(dan)固(gu)(gu)醇運動，我們在分(fen)離的(de)線粒(li)(li)體中加入重組(zu)Mcherry標記的(de)perfringolysin O(Mcherry-D4)膽(dan)固(gu)(gu)醇結合域，建立了(le)(le)一種線粒(li)(li)體膽(dan)固(gu)(gu)醇定量方法(fa)。后續(xu)通過一系(xi)列實驗證(zheng)明GramD1C是線粒(li)(li)體膽(dan)固(gu)(gu)醇豐度和線粒(li)(li)體生物能量學的(de)負調(diao)(diao)節(jie)因子。

Gram家(jia)族表達對CCRCC預后的影響(xiang)

通過(guo)TCGA數據庫分析腎透(tou)明細胞(bao)癌(ai)(KIRC)腫(zhong)瘤基(ji)因(yin)表達數據中(zhong)完(wan)整的(de)Gram1C家族在CCRCC中(zhong)的(de)參(can)與情(qing)況，及(ji)患者(zhe)生存的(de)相關性(xing)，發現(xian)GRAMD1C、GRAMD2B是腎透(tou)明細胞(bao)癌(ai)(CCRCC)患者(zhe)預后的(de)不利(li)因(yin)素；Gram家族成員可能是通過(guo)調節(jie)新陳代謝和癌(ai)細胞(bao)存活率來調節(jie)CCRCC患者(zhe)的(de)總存活率。